🔬 实验名称：高保真固定液与 4 种封片剂对微丝结构细节保存的影响
🎯 本章内容：清洗染料 / 注入后固定液 / 擦拭封片剂 / 清洗固定液 / 吸掉水珠
🎯 本章内容：清洗染料 / 注入后固定液 / 擦拭封片剂 / 清洗固定液 / 吸掉水珠
过夜孵育完成后，进入清洗 + 后固定 + 封片前准备阶段：清洗染料、注入后固定液、擦拭封片剂、清洗固定液、吸干样本水珠。
🧭 整体步骤：清洗染料 ➜ 注入后固定液 ➜ 擦拭封片剂 ➜ 清洗固定液 ➜ 吸掉水珠
一、清洗染料
每一个湿盒上面附有水蒸气，对湿盒进行染料清洗。
操作步骤：
- 5.1.1 沿着小皿侧边加入 PBS 缓冲液。
💡 加入 PBS 缓冲液后，制样伴侣会自己飘起来。 - 5.1.2 用镊子把制样伴侣夹出来。用镊子挑边儿，夹出制样伴侣，不要触碰到细胞爬片以免划伤细胞。
- 5.1.3 重复快洗两次（染料不用清洗 5 min，重复快洗两次即可）。
🧪清洗用具
制样 PBS 和无菌水。
💡 操作 Tips：
- Tips1：无菌水、PBS 必须使用严格无菌无内毒素的，PBS 溶液的 pH 值需准确。
- Tips2：加入 PBS 缓冲液，制样伴侣会自己飘起来。
- Tips3：在小皿边缘加 PBS 溶液，不要对着中间有细胞的区域冲洗。
- Tips4：加入 PBS 溶液后再用镊子夹起制样伴侣。
- Tips5：用镊子挑边儿，夹出制样伴侣，不要触碰到细胞爬片以免划伤细胞。
- Tips6：如果染料不一致，每夹一次都要清洁擦拭镊子头部，避免串色。
- Tips7：短时间操作可忽略实验室白炽灯白光的影响。长时间放置，要避光处理，尽量避免暴露在白光紫外线中，因为灯光中含有紫外线。
二、注入后固定液
做后固定，用以固定标记物组，长久的保存样片。
- 步骤 1：贴边加入小皿，需要 2 ml 后固定液才能完全覆盖细胞爬片。
- 步骤 2：给后固定定时 10 分钟，室温固定。
💡 操作 Tips：
- Tips1：1 ml 加入 35 mm 塑料底小皿（不带底部凹槽）是无法完全覆盖细胞的。
- Tips2：加入后轻轻晃一下，使溶液充分覆盖。
- Tips3：固定液有甲醛挥发，需要加皿盖。
三、清洁玻片，预热封片剂
4 号封片剂需要 80℃ 热化，是一种光固化凝胶。
载玻片上可能有灰尘、水渍、细菌等，需要清洁处理。
🧻擦拭玻片
用无水乙醇喷湿无尘纸，把玻片擦干净，再用洁净的干燥无尘纸擦拭一遍。
💡 Tips1：擦到无明显的灰尘颗粒物。
💡 Tips2：普通的载玻片边缘有毛刺，非钝角，有划伤风险，建议购买高质量边缘平滑的载玻片，整体平整度也更高。
💡 Tips2：普通的载玻片边缘有毛刺，非钝角，有划伤风险，建议购买高质量边缘平滑的载玻片，整体平整度也更高。
封片剂尽量控制在 20 µl 之内。
⚠️ 封干片的时候会用到热熔胶。
🚫 不要用指甲油封片，指甲油有很高的自发荧光，很容易沾到物镜上。
🚫 不要用指甲油封片，指甲油有很高的自发荧光，很容易沾到物镜上。
四、清洗固定液
十分钟后，固定液固定完成，用 PBS 溶液和无菌水来先后彻底清洗样本，去掉所有离子。
- 步骤 1：用吸头在小皿边缘吸掉溶液，用 PBS 溶液清洗 3 遍。
- 步骤 2：边缘吸掉 PBS 溶液，用无菌水再洗 5 遍。
- ⚠️ Tips：注意每次操作都要在小皿边缘吸取注入溶液，避免伤到细胞。
五、吸掉样本上的水分
玻片吸水变干。
💧操作步骤
- 5.5.1 在片子和底下的皿交界的地方，用镊子使一些力把玻片轻轻翘起来。
- 5.5.2 用手扶一下玻片，同时用镊子捏住玻片边缘夹起来。
- 5.5.3 把玻片靠着小皿，菱形放置，水会顺着玻片角，流到干纸上，利于吸干。
- 5.5.4 直接用吸液器吸干。不建议长期晾置，可能会出现环境意外扰动。
💡 操作 Tips：
- Tips1：放置玻片沥水时一定要记住正反，细胞面对着自己。
- Tips2：夹出玻片时可以借着水的浮力把它挑出来。
- Tips3：立着放水就会往下滴。
- Tips4：吸液体时背面没有细胞可以先吸，有细胞那一面，只在立放的底部角吸。吸掉水珠后它会迅速干掉。
- Tips5：这种”磨砂样”的干片就是最终样子。灰白色的物质就是细胞。
—— 高保真微丝固定 · 图文实验流程（五）——