🔬 实验名称：高保真固定液与 4 种封片剂对微丝结构细节保存的影响
🎯 本章内容：清洗、滴染料、贴膜、孵育过夜
🎯 本章内容：清洗、滴染料、贴膜、孵育过夜
固定完成后，进入免疫荧光标记阶段：清洗、滴染料、贴膜、喷盖子、倒扣小皿、4℃ 过夜孵育。
🧭 整体步骤：PBS 清洗 ➜ 吸液 ➜ 滴染料 ➜ 贴膜 ➜ 喷盖子 ➜ 倒扣小皿
一、用 PBS 快洗固定后的样品 3 遍
PBS 质量要求
无菌、新鲜、pH 值准确。PBS 小份相对大桶 PBS，即用即开，更容易保持无菌无内毒素。
为什么要用 PBS 清洗固定液？
免疫荧光需要在恒定的 pH 值下进行。若无缓冲液，任何酸或碱含量的微小变动都会引起大幅 pH 偏移。换液洗涤通常使用 PBS（磷酸盐缓冲液），靶蛋白、染料等都对 pH 值非常敏感，适宜的 pH 范围一般在 7.2-7.4 之间。
操作步骤：
- 步骤 1：吸掉小皿工作液，稍微侧一下边，在边缘吸取，切勿损伤细胞。
- 步骤 2：在小皿边缘加入 PBS，切勿对着小皿中心爬片冲洗，可能会冲掉细胞。换液后不需要摇床，手动轻轻摇晃即可清洗。
- ⚠️ Tips：加入的 PBS 溶液剂量要能覆盖包裹爬片，体积约 2 ml。
- 步骤 3：再重复两次，把固定液洗干净。
二、吸液 ➜ 滴染料 ➜ 贴膜 ➜ 喷盖子 ➜ 倒扣小皿
吸液
操作步骤：
- 步骤 1：把移液枪调整到 30 µl。
- 步骤 2：尽可能把液体吸干净，把细胞爬片的边角也吸干净。
- ⚠️ Tips：避免干片，快速操作，在爬片上保留少量液体，干片后会增加非特异性抗体吸附。
滴染料
操作步骤：
- 步骤 3：30 µl 混匀好的染料工作液，滴加在爬片中间，如有剩余的一小滴轻轻在爬片表面蹭一下（不要在中间有概率划到细胞）。
贴膜（用制样伴侣覆盖爬片）
用制样伴侣覆盖爬片，使爬片上的染料均匀覆盖细胞。
操作步骤：
- 步骤 1：夹起制样伴侣的小耳朵，使其边缘贴着爬片角覆盖，轻轻戳碰中间，制样伴侣会自动吸附贴膜。
- 💡 Tips：气泡多往边缘赶一赶，小气泡可以无视，孵育时间长它会自动消失。
- 步骤 2：调整制样伴侣小耳朵，圆形贴膜基本切着方形爬片四边。
喷盖子 ➜ 倒扣小皿
操作步骤：
- 步骤 1：小皿孵育细胞需要湿润环境，用小喷壶轻喷几下盖子。
- ⚠️ Tips1：注意喷的是盖子，切勿喷到配置好溶液的小皿中，否则变动小皿 pH 值会影响孵育效果。
- ⚠️ Tips2：纯净水必须是无菌的。
- 步骤 2：将孵育好的小皿倒扣在盖子上，液体的表面吸附力不会让制样伴侣和细胞爬片掉下来。
- 💡 Tips1：孵育时一直保持倒扣状态，皿盖的水会形成湿盒效应，不会干片。
- 步骤 3：重复操作剩余 5 个小皿。
- 重复步骤：吸液 ➜ 滴染料 ➜ 贴膜 ➜ 喷盖子 ➜ 倒扣小皿
- 步骤 4：完成后放入冰箱孵育。4 ℃ 过夜孵育，时间约 12 小时。
—— 高保真微丝固定 · 图文实验流程（四）——