本文主要内容：加固定液
1 拿出活细胞，吸出培养基，分别加入预热好的常规固定液和高保真微丝固定液
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2 放到金属浴保温，设定时间十分钟
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3 循环操作剩余样品
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固定要点：
温度不能变，设定为37℃（实际设定为38.5℃，按照室温浮动设定）
添加固定液时不要冲着培养皿中间加，培养皿中间有个细胞爬片，要贴着皿壁加进去，避免冲刷到细胞。
hxicollege
本文主要内容：配置封闭打孔液、配置染料、配置后固定液
1 配置封闭打孔液:
1.1 封闭液：
旨在减少抗体与样本的非特异性结合问题，降低背景荧光，突出信号；免疫荧光实验中的“样本”表面，除了靶标特异性抗原外，还存在大量“空白”区域。可能有电荷或具有疏水性，粘附蛋白抗体；也可能含有一些细胞表达的 Fc受体、固定剂交联物、细胞碎片等，他们都会吸附抗体，产生假阳性信号。在加入一抗之前以及在一抗、二抗孵育的过程中，都用非特异性的、非反应性的蛋白质孵育样本，通过占位和竞争，饱和占据非特异性位点，将特异性的抗原表位留给真正需要结合的一抗和二抗。
1.2 打孔液：
旨在解决抗体进入细胞内部的效率问题，增加标记的丰度。细胞膜和核膜是磷脂双分子层构成的天然屏障，它们只允许小分子或特定物质通过，大分子如抗体（通常是150 kDa左右）无法自由穿透。打孔剂的作用是破坏细胞膜的完整性，在膜上形成微小的孔洞。
实验名称：高保真固定液与 4 种封片剂对微丝结构细节保存的影响
本章节的主要内容：配置固定液
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样品1：常规固定液（4%PFA）
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样品2-样品 5：高保真微丝固定液
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实验用具：
3支移液枪
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5ml注射器 和 2ml 注射器（取微丝固定液）
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镊子（或者其它硬物顶开西林瓶）
吸液管
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无菌无内毒素的超纯制样PBS
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配置试剂步骤
① 用马克笔在15ml 离心管上标记control字样，给该15ml离心管中注入2ml常规固定液。
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② 用马克笔在试管上标记HF(high fidelity)字样，开始配置高保真微丝固定液。
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高保真固定液三种成分：
1. 成分一：Cell Actin Fixation Solution I
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⭐️图像描述：整个细胞呈现出圆扇形，扁平地铺展在视野中， 细胞内的微管呈辐射状排列，连续、均匀、明亮。这是一张3D成像的2D投影图，通过颜色信息区分高度，灰色代表细胞较低的区域，橘色代表较高的区域。
⭐️标记要点：
1、培养贴壁良好、高活力且细胞体扁平的细胞。
2、微管是对温度极其敏感的细胞器。从培养箱取出到固定的全过程，必须严格避免温度波动。
3、选用适合微管的高保真固定液，防止微管解聚。
4、为使背景更干净，使用Quench试剂来抑制自发荧光。
5、使用比常规推荐浓度更高的一抗浓度去进行过饱和标记。
⭐️成像要点：
1、细胞存在异质性，要避开处于分裂期的细胞。教科书般的辐射状细胞，在一盘细胞中通常仅占5%~7%，精心挑选视野。