案例 01：高保真超分辨样本-细胞微管3D共聚焦成像
🧪Protocol for high-fidelity Fixed 3D Confocal Sample
- 高保真微管固定，使用高保真固定液-微管37 ℃固定细胞 10min；
- 使用2ml 超纯制样PBS简短的清洗细胞 3 次；
- 压制背景荧光，使用2ml配置好的 自发荧光抑制剂，在室温下孵育样本 7min，使用侧摆摇床辅助交换液体；
- 使用2ml 超纯制样PBS简短的清洗细胞 3 次；
- 封闭抗体非特异性结合位点，使用 50ul 配置好的封闭打孔液，同时使用 制样伴侣-贴壁样本辅助样本的孵育，室温下孵育细胞 30 min；
- 使用 制样伴侣-贴壁样本辅助一抗孵育，保持湿润环境，室温孵育 1 小时。一抗选择 beta-tubulin E7 mouse；
- 使用 2ml 超纯制样PBS清洗一抗，5min 一次，清洗3次，使用侧摆摇床辅助交换液体；
- 抵御非特异性荧光染料结合，使用25ul 荧光净化增强液，同时使用 制样伴侣-贴壁样本辅助样本的孵育，室温孵育样本 30min；
- 使用 制样伴侣-贴壁样本辅助二抗孵育。保持湿润环境，室温孵育 1 小时。二抗选择 Alexa555 goat-anti-mouse IgG。
- 使用 2ml 超纯制样PBS清洗二抗，5min 一次，清洗3次，使用侧摆摇床辅助交换液体；
- 使用 超分辨光镜级PFA-16%，预制成 4%浓度，取 500ul 浸没样品进行后固定，时间10min。
- 在成像时，使用Antifade成像缓冲液，进行 3D Confocal成像。
⭐ 图像描述：
整个细胞呈现出圆扇形，扁平地铺展在视野中，细胞内的微管呈辐射状排列，连续、均匀、明亮。这是一张3D成像的2D投影图，通过颜色信息区分高度，灰色代表细胞较低的区域，橘色代表较高的区域。
⭐ 标记要点：
- 培养贴壁良好、高活力且细胞体扁平的细胞。
- 微管是对温度极其敏感的细胞器。从培养箱取出到固定的全过程，必须严格避免温度波动。
- 选用适合微管的高保真固定液，防止微管解聚。
- 为使背景更干净，使用Quench试剂来抑制自发荧光。
- 使用比常规推荐浓度更高的一抗浓度去进行过饱和标记。
⭐ 成像要点：
- 细胞存在异质性，要避开处于分裂期的细胞。教科书般的辐射状细胞，在一盘细胞中通常仅占 5%~7%，精心挑选视野。
- 该图像拍摄了 Z 轴连续 7 层以上的图像栈（Stacks）。层间距（Step size）设为 0.05~0.1 μm。
- 3D 层扫数据，非常适合进行 3D 去卷积处理，能极大提升共聚焦图像的信噪比（SBR）。
⭐ 标记信息：
细胞：BSCI细胞
一抗：beta tubulin E7
二抗：Alexa555
⭐ 成像模式：
3D confocal 模式，Olympus FV3000 点扫描共聚焦显微镜；原始图像经过了 3D 去卷积（Deconvolution）处理，使微管纤维看起来更加干净、连续。
⭐ 总结：
一张”满分”的微管图 = 完美的扁平细胞 + 严格的温控高保真固定 + 过饱和标记 + 精准的视野挑选 + 小间距 Z 层扫 + 去卷积后期处理。希望对大家的实验有所启发！
—— 案例 01 · 图文实验梳理 ——