为什么细胞微丝总是标不到细节结构？问题在这里！（一）

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🔬 实验名称：高保真固定液与 4 种封片剂对微丝结构细节保存的影响
🎯 本章内容：配置固定液

本章讲解 高保真微丝固定液 的配置流程：样品分组、实验用具、配置试剂步骤、预热处理、操作 Tips。

一、实验样品

🧪 样品 1：常规固定液（4% PFA）作为对照组基准参照。
🧪 样品 2-5：高保真微丝固定液，针对微丝纳米结构细节专门优化。

二、实验用具

3 支移液枪（不同量程配套，覆盖取液全流程）
5 ml 注射器和 2 ml 注射器（用于吸取微丝固定液）

镊子（或者其它硬物顶开西林瓶）
吸液管
无菌无内毒素的超纯制样 PBS

三、配置试剂步骤

①step标记 control

用马克笔在 15 ml 离心管 上标记 control 字样，给该 15 ml 离心管中注入 2 ml 常规固定液。

②step标记 HF（high fidelity）

用马克笔在试管上标记 HF (high fidelity) 字样，开始配置高保真微丝固定液。

🧪高保真固定液三种成分

成分一：Cell Actin Fixation Solution I 5 ml 16% 超分辨光镜级多聚甲醛
成分二：Cell Actin Fixation Solution II 40 µl 50% 超分辨光镜级戊二醛
成分三：General Actin Buffer 5 ml（通用微丝缓冲液）

⚠️ 成分三注意事项：
• -80℃ 保存有效期约 12 个月
• -20℃ 保存时间为 1-3 个月
• 4℃ 无法保存
• 正常试剂解冻后呈现透明无色澄清的状态
• ❌ 反复冻存后会出现砖红色的沉淀，此时试剂属于失效状态已经无法使用
• 💡 尽量一次用完；一次用不完，建议分装后 -80℃ 保存，随用随取解冻后使用。

🧮用量计算

放置了细胞爬片的塑料 3.5 mm 小皿：需要 2 ml 工作液才能完全覆盖爬片。

工作液配比：
• 1 ml 成分一 Cell Actin Fixation Solution I
• 1 ml 成分三 General Actin Buffer
• 配 8 µl 成分二 Cell Actin Fixation Solution II

比例为 0.5 ml ：0.5 ml：4 µl
即 1 ml 成分一和成分三混合液，配比 8 µl 成分二。
本次实验每个小皿，各需要 2.08 ml（约 2 ml） 固定工作液。
为配比足够制备 5 个小皿 的固定工作液，配置 5 倍工作液，即：5 ml：5 ml：40 µl。

🔧配置步骤

1step吸出成分一 Cell Actin Fixation Solution I 5 ml

2step吸出成分三 General Actin Buffer 5 ml

3step吸出成分二 Cell Actin Fixation Solution II 40 µl

4step混合溶液 ✅

四、预热处理

③step配置完成的 高保真固定液（包括普通固定液）和封闭打孔液一定要预热到 37.5℃。

💡 图中预热到 38.5℃ 是因为室温比较低，所以稍微上调了一些。

封闭打孔液是提前配好的，成分：

#	名称	规格	数量	储存
1	Sunbloss® Blocking & Permeabilization Solution I	0.5 ml	36	-20 度储存
2	Sunbloss® Blocking & Permeabilization Solution II	1.8 ml	1	室温 25 度储存

五、操作 Tips

🧪西林瓶打开技巧

按照箭头指示用硬物从下往上顶开，铝箔片自然会被带起。

💉西林瓶取试剂技巧

从中间孔插进去，有负压，要用大拇指用点力去推针管。
把西林瓶倒扣过来，针头尽量不要吸到空气，吸到空气就把针头向上，把空气打回去。

🛡️注射器使用安全

注射器用完要盖上盖子再去掉。
每支注射器只吸取一种液体，取其他 buffer 请更换注射器。

📐请注意工作液充分浸没细胞

小皿类型	所需工作液
3.5 mm 共聚焦玻底小皿（带凹槽）	凹槽中需要 500 µl 工作液以上就可以充分浸没
3.5 mm 塑料底小皿＋细胞爬片	需要 2 ml 工作液才能完全包裹覆盖爬片

⚠️ 固定液需要预热到 37 度，请用金属浴或水浴锅实现预热。

—— 高保真微丝固定 · 图文实验流程（一）——