All true knowledge begins with direct experience.
—— 列奥纳多·达·芬奇
——Leonardo da Vinci
摘要…………………………………..Part I
细胞形态研究小史………………Part II
与美有关的细胞的形态调控..Part III
3.1 通过细胞代谢调节获得更有活力的细胞
3.2 利用细胞周期控制细胞身体素质稳态
3.3 改变粘附和培养环境获得充分舒展的细胞
细胞之美总结……………………Part IV
我的展望…………………………..Part V
扩展阅读………………………….Part VI
单细胞形态之美，不在传统生命科学领域的讨论范围内，但却是细胞成像的命门。显微镜的出现造就了生命忠实的观察者——我们。遗憾的是，我们很少主动与被观察的细胞合作。显微成像是科学与艺术交织的高能奇点。美，是成像的基本需要。事实上，主动调控细胞形态可以满足美的需要。让生命恒美，就是表达对它的敬重。如果你能明白，显微成像是一场细胞为模特的维密秀，那么你就会知道，训练模特是必须要做的事。
图1，A. 单细胞的美。B. 单细胞的异常状态。两张图都含有微管微丝和其他细胞器。A图从排布、秩序、一致性、均衡度等角度都强于B。在感官上，能够直观的看出巨大差异。
*除非特别定义，本章对美的定义是健康，高活力，尺寸适宜。不涉及细胞特殊形态和特殊意味的美。图 A隶属于华夏成像公司创始团队，由我们培养、制样和成像，该图成为 Olympus SpinSR10 高分辨显微镜的产品封面。
为了带你领略卓越细胞的诞生，本章首先将会为你展示，波澜壮阔的细胞形态研究史；接着是如何从细胞起源、进化、代谢、周期、粘附等角度帮助细胞找到最佳状态；最后，我们探讨人类的培养行为，如何与细胞的生活共舞，并影响整个微观世界。
阅读本章，你将会成为深谙与被观察生物合作之道的研究者之一。我们将会一同建立全新的研究平台。在这里，新知识将诞生于和谐美好的成像图景中，一致性将会增加。科学与宇宙在美的旋律中谐振，我们将会一起书写学科的未来。
在过去的百年间，人们发现了细胞存在最佳体积范围[1]，它是产生优美细胞的必要条件。例如，在浮游生物中，光合作用、生长速率、线粒体效率在中等尺寸的细胞中达到峰值[2]，而在较大和较小的细胞中逐步降低[3][4]；最近的证据表明，甚至在单细胞和多细胞生物中也是如此[5][6][7]。
本质上，细胞是一座生物化学分子的反应池，池内分子浓度决定着反应速率。分子浓度和细胞尺寸如果成比例的改变，浓度恒定，这个现象就是“缩放”，细胞分子浓度稀释，称为“下缩放”，反之则称为“上缩放”。在一百年前，科学家发现受损的阿米巴虫一旦尺寸小于临界值就不再分裂[8]；大约五十年前，科学家发现 whi5 基因缺失导致细胞尺寸异常增大[9][10]，进而在十年前提出whi5“下缩放”到临界值时，细胞启动分裂进程。拟南芥的同源基因KRP4[11]，人类的同源基因 Rb 都通过“下缩放”实现类似功能[12]。细胞尺寸超额改变，伴随分子“缩放”的异常，通常意味着细胞不再拥有理想健康状态。例如，当细胞过小时，生物合成受限，离子梯度维持困难，且细胞对凋亡敏感[6]。随着细胞增大，细胞转录[13][14]和翻译效率[15]提高，且RNA降解效率变低[16]。值得注意的是，细胞过大会引发衰老机制，在酵母[17]、哺乳动物细胞[18]、造血干细胞[19]，植物[20]中都有发现。近期大细胞机制被用于杀死癌细胞，研究人员使用CDK抑制剂引起G1停滞，使癌细胞过大诱发其衰老[21][22]。
图2. 存在细胞最佳尺寸范围[6]，范围内的部分细胞的功能达到最大化。细胞群体的适应度在中等大小的细胞达到峰值；而在过大和过小的细胞中，都表现出劣势。
处于最佳尺寸的细胞，其细胞状态（而不是繁殖能力）决定了细胞更大概率拥有美和活力。两者经常被混淆。细胞状态，类似于运动员的身体素质；而繁殖能力，是细胞从数量上复制自身的能力。处于不同状态的细胞，从形态、组成和功能上都有差异。
在以下章节中，我们从细胞状态角度来讨论这些差异，以及给出一些实用的提升建议。提高细胞状态的话题包罗万象，但有几个脉络是非常重要的，包含：细胞代谢、细胞周期、细胞粘附和培养环境等。你将会了解，细胞因身体素质佳而表现出来美感背后的原理，以及一些使细胞变美的办法。
最佳尺寸细胞呈现出最佳的代谢活性，代谢活性决定了转录和翻译活跃度，即蛋白合成活跃度。在数十种细胞系中，线粒体产生的ATP量始终约等于蛋白质合成的能量需求。线粒体代谢和生长率在细胞特定的大小时达到最大值[23][7]；当细胞减小时，线粒体活性也会下降[3][4]。在转录分子层面，限制性聚合酶PolII的基因组占据率随着细胞增大而增加[24][25]，而mRNA降解速率降低[1]；在翻译分子层面，mRNA和核糖体数量都随着细胞大小增加[26][27]。然而，活性核糖体比例可能是总翻译率的限制因素，原因是活性核糖体的比例随着细胞增大而减小[28][29]。
整体来看，在最佳尺寸范围内，细胞质量密度（干质量/细胞总体积）随着细胞增大而“亚线性”增加[1]。干质量由蛋白、核酸和脂质组成，而细胞体积主要由离子和核酸等小分子组成。因此细胞干质量取决于基于代谢的生物合成水平。细胞质量密度的增长曲线符合克莱伯定律异速生长关系[30]，即增速随着尺寸增加而降低。然而，一旦细胞过大，细胞质量密度会急剧下降[31]，这和我们之前提到的大细胞衰老证据相呼应。以上证据表明，在最佳尺寸范围内，细胞代谢活性也随着细胞增大而增加，大细胞高代谢有利于细胞发展强健的身体素质。然而，超越了最佳范围，细胞将会迅速衰老。
对较大细胞而言，细胞膜完整性是细胞获得更强身体素质的主要限制因素。多数细胞器，如细胞核、线粒体、纺锤体等都随着细胞体积增加而增多；即使脂质合成速率也在较大的人类细胞中更高[32]。然而，细胞膜的厚度却是一定的。事实上，当细胞持续增大，导致表面积体积比下降到一定程度，脂质合成的基因亦会显著下调[33]。过量胆固醇（细胞膜组成物质）会和胆固醇调节结合元件结合蛋白（SREBP）结合。SREBP会反过来抑制甲羟戊酸途径–即胆固醇自身的合成途径。该途径也产生其他物质，比如膜蛋白翻译后修饰的香叶基、法呢基基团，这些基团除了用于组成膜，还用于线粒体的电子传递。因此，细胞膜通过其自身的结构完整性调节代谢水平以及膜自身的合成，控制着高身体素质细胞的尺寸上限。
当我们想要获得理想的细胞，不妨从代谢知识中下功夫。比如：首先通过增加线粒体的活性（而不是数量）以保证代谢水平，可以采用的手段有：添加辅酶 Q10、pQQ、omega3、麦角硫因等；其次，补充适量的细胞膜合成脂质是有帮助的，比如加入含有磷脂合成前体的脂质补充剂。这样做的好处是，即使细胞过大，也能减轻代谢因膜量不足而被抑制的程度，预防较大的细胞过早进入衰老。
表1：从细胞代谢入手，获得更有活力细胞的方法
细胞系的体积是动态变化的。HeLa细胞体积的经验值约为2000 μm³，实际范围却为500–4000 μm³。在分裂和重新接种后的三天和七天比较细胞时，体积可以减少两倍以上[42]；这不仅是细胞分裂的结果，更是细胞系进化的结果。原因是，分裂速度快的细胞，会逐渐从数量上占据主导，并导致细胞群体尺寸越来越小，细胞更容易凋亡。这是体外细胞系培养且不加干涉的自然结果。
图3，细胞系进化[43]。纵轴表示总细胞数，细胞产量在纵轴上以对数刻度表示，培养时间在横轴上以线性刻度表示。图中连续细胞系在14周时出现（即体外转化），但对于不同的细胞，它可能在任何时间出现。随着每次连续的传代，具有最快速增殖能力的群体成分将逐渐占主导地位，而不增殖或增殖缓慢的细胞将被稀释。
最佳细胞尺寸，对细胞周期和细胞生长都很敏感。实际上，真核细胞通过平衡分裂和生长来控制自身的大小。细胞周期分为四个阶段：G1、S、G2和M。在G1期间，细胞受到细胞周期进程检查点的调控，决定细胞是重新进入周期、退出并生长或退出并分化。在Rb等细胞周期抑制剂的作用下，细胞周期可以在G1的限制点停止，更多的生物合成时间造就了更大的细胞。而衰老细胞的过大体型，被认为是退出细胞周期后，依然不节制生长的结果[44][45]。细胞周期亦受环境信号的调控，低细胞密度使每个细胞具有自由边缘并使其能够扩散，这使得它们在有丝分裂生长因子（EGF、FGF、PDGF）存在的情况下进入细胞周期；高细胞密度会抑制正常细胞的增殖，而发生转化的细胞的增殖则不受影响。重要的是，有研究报道高拥挤度下的细胞会因为挤压而损伤细胞核[46]。因此，高密度不仅对单个细胞的身体素质是有害的，还有可能促进细胞系因转化而整体变异。
图4. 细胞周期[47]。细胞周期分为四个阶段：G1、S、G2和M。在G1期，受到Rb等周期抑制剂的作用，生物合成时间延长，这可以造就更大的细胞。
体内真核细胞的体积跨越了14个数量级以上，形态和功能迥然不同的细胞都保持着尺寸的稳态。恒定体积意味着——与较大的细胞相比，较小的细胞在每个细胞周期中相对而言会添加更多的体积。因此，随着子细胞大小的自我修正，尺寸稳态会通过均值回归自动实现[6]。
表2. 不同类型细胞的特征体积[42]。分裂和不分裂细胞，在体内都保持着尺寸稳态[6]。
体内细胞基于自我修正的尺寸稳态提示我们，在体外培养时，我们依然可以且应该通过调控细胞周期使细胞维持在最佳尺寸范围。比如：首先，低密度和保持细胞的自由边缘；其次，对冲细胞系向小进化的趋势，使用细胞周期阻断结合生长因子助推小细胞整体向大移动；最后，对于体积正常的细胞，预防衰老风险，有节奏的刺激细胞进入有丝分裂，比如，通过IGF、亮氨酸、佛波酯等刺激细胞提前进入细胞周期。让整体尺寸回归最佳细胞大小。
表3. 从细胞周期角度，获得最佳尺寸稳态的细胞的方法，在这个范围内，有最高概率产生高身体素质的细胞。
*虽然细胞的衰老是一个必然，但是这些做法可以延长细胞处于高概率拥有强身体素质的最佳尺寸范围的整体时间跨度。
充分粘附和舒展可赋予细胞更好的形态。很容易发现，即使处于细胞间期，细胞形态也会产生显著变化。HeLa细胞粘附于细胞外基质，扩散至直径约为40 μm，但高度仅为几个μm。当生长汇合时，它们相互挤压将直径压缩至约20 μm[42]。细胞会附着并铺展在带有少量净负电荷的玻璃上，如果用强酸、等离子体放电或高能电离辐射对某些塑料（例如聚苯乙烯）进行适当处理，细胞就会附着在这些塑料上。细胞铺展之前，分泌细胞外基质蛋白和蛋白聚糖，这些外泌基质粘附在带电的基质上，然后细胞通过特异性受体与基质结合[52]。
图5. 上层：细胞粘附的过程；下层：细胞外基质 (ECM)。典型成分包括胶原蛋白、蛋白聚糖（糖周围有水合壳）、连接蛋白和层粘连蛋白[53]。
图6，不同粘附程度的细胞，内在骨架秩序呈现显著差别（图片来自蔡司显微镜在线大学https://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/）。
培养基和培养环境都会影响细胞形态。包括：1.基质，比如在塑料上培养和在凝胶上培养的细胞会显著不同，较硬基质导致细胞体积或面积增加[54][55]。2. 培养基营养物质的构成(激素和生长因子等)，例如：2.1芽殖酵母和裂殖酵母的细胞在贫瘠的培养基中会变小，而在富含营养的培养基中会变大[56]；2.2生长因子的信号转导会通过保护G1期的细胞周期蛋白免于被降解，从而稳定和促进G1/S期转换；2.3当尺寸适宜的细胞在营养物质丰富的环境中，TOR和PKA通路均处于活性状态时，CDK活性会降低，并最终允许细胞通过G1/S的转换点，继续细胞分裂。3. 气相的组成。气相影响的极端的例子是大约3亿年前，高氧环境可能导致单细胞原生生物体型巨大[57]。4. 培养温度。细胞在较高温度下或热休克后会变得更大，只不过，过量的体积增加可能是热休克引起死亡的原因[58]。
因此，更美的细胞可以经由促进粘附和调整培养环境完成。不论培养载具来自商家还是自制，都需要确保使用经过促粘附处理玻璃或塑料，以提供更好的细胞粘附外环境。十分推荐自己做一遍以保证玻璃是最好的粘附状态。比如，使用纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白或衍生物明胶、RGD 合成肽做预处理，帮助更挑剔的细胞附着并延伸出良好的形态。培养基中的生长因子等营养物质也需要有强活性。当你的细胞过小时，试着稍微提高氧气浓度或温度，可以看到细胞形态的改善，但要注意在细胞衰老（过大）前及时收手。
表4. 从细胞粘附和培养环境角度，获得充分舒展形态优美的细胞
细胞的美是可以被造就的。秘诀就是围绕细胞的重要生命过程，打造最佳细胞的诞生条件，通过代谢和膜量、细胞分裂和生长、细胞粘附和培养环境等方面，我们已经窥探到如何与小小的、却令人惊奇的细胞合作。
我们已经了解，拥有高代谢活性是最佳细胞的基本特征；而且可以从细胞膜切入，来抵御较大的细胞的过早衰老；我们已经知道，可以通过调节细胞的分裂和生长的天平来让细胞保持尺寸的稳态，因为我们了解在这个范围内的细胞，拥有最佳的身体素质；我们深知，通过营造一座充满友善粘附分子的花园，细胞将会乐意展开华丽的伪足，就像一个开心的女孩儿甩开裙摆。
由于我们相信自己已经更了解细胞，在培养方式上，我们也打开了想象力。改变环境可以帮助引导细胞状态走向。培养基对源自体内的细胞系来说，是一个严重欠缺稳态调节的环境。这些复合的方法或许对大多数这个年代的培养者都有帮助。细胞们至少，比在培养者什么都不做的情况下，稳定得多。
也许你已经发现，我们参悟如何与细胞共舞的钥匙，就是去研究自觉的细胞自己会做哪些事？当然，细胞并不会时时都自觉，所以，我们和细胞，才需要彼此的深度了解和频繁呼应。去试试吧！细胞会告诉你它的想法。
培养具有美感的细胞，不管你是否承认，这都是我们在研究中在用本能追求的事。美与真有着千丝万缕的深度关系，可以说，美就是真！我们在科学中析判宇宙万物之理，万物本可以包含在一朵健康的细胞之中，就看你准备怎么做。
所有真知都始于感官，以健康和美为基础的研究平台，是一个奇迹孕育之所。基于理想的细胞，数据的一致性将会增加，每一份数据都诞生在和谐的秩序之中。我们在稳健的细胞宇宙的基础之上，才可能构建更加大胆的研究体系；而过去，有些体系因为细胞的不稳定而难以实现。我们懂了它们，与它们和谐共舞，科学从此，因为我们开始与微观世界合作，进入了新的纪元。
我们终将明白如何使细胞健康，并把这些知识用于提高人类的细胞健康上，就像现代细胞生物学为人类健康已经做出的那些贡献一样。
你必须让模特们准备好。这是一个秘密，只有少数顶尖的成像学家知道的秘密。现在你已经知道了，你将会如何使用它呢？
为了不影响你的阅读体验，仅在你需要的时候，可以找回这里。它一直在这里等你：考虑了以上所有因素的华夏成像细胞培养AB培养基（点击阅读原文），让你的细胞健康实现本质的飞跃。
值得注意的是，本篇不含细胞污染，细胞污染的提出会使篇幅超纲，毕竟在没有污染的完美环境下培养，已经有如此多因素要讨论了。因此我决定在其他篇章中讨论细胞污染。
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