本文素材来自ibiology 系列课程，star cellbio，EMBL，Allen istitute和平时的积累。
PS：ibiology是生物学学生的殿堂，欢迎关注ibiology～
本文的主要脉络是大伙心目中的大生物学家Ron Vale的ibio课程，解决问题的思路清晰到不行！我们就来听生物学家Ron说说，如何选择一款显微镜。🔬
本文的核心关键词有三个：解决问题 解决问题 解决问题
目录：
Part I 首先，你要问自己
Part II 是否需要荧光显微镜
Part III 如果选了荧光显微镜...
Part VI 你所关注的，不仅是荧光
PartI 首先，你需要问自己
生物学家总是会从问题出发，这是一个极其良好的思考习惯。那在真正浏览显微镜之前，你需要问自己几个问题。
本文素材来自ibiology 系列课程，star cellbio，EMBL，Allen istitute和平时的积累。PS：ibiology是生物学学生的殿堂，欢迎关注ibiology～本文的主要脉络是大伙心目中的大生物学家Ron Vale的ibio课程，解决问题的思路清晰到不行！我们就来听生物学家Ron说说，如何选择一款显微镜。🔬本文的核心关键词有三个：解决问题 解决问题 解决问题目录：Part I 首先，你要问自己Part II 是否需要荧光显微镜Part III 如果选了荧光显微镜…Part VI 你所关注的，不仅是荧光PartI 首先，你需要问自己生物学家总是会从问题出发，这是一个极其良好的思考习惯。那在真正浏览显微镜之前，你需要问自己几个问题：1，what do you hope to learn?你想要回答什么问题？你需要什么样的成像数据。这是做决定最重要的部分。2，What do you have available?你的实验室平台有什么设备？手边有的设备会帮助你解决实际问题。3，How can you quantitate your images?你该如何分析你的数据。人们早已不满足于仅仅拍出漂亮图像而已，图像中内涵大量的信息，这些信息的提取对回答生物问题尤其重要。下面的章节，将会出现很好的研究实例。Part II 是否需要荧光显微镜透射光显微镜和（反射）荧光显微镜一张图解释什么事透射显微镜和荧光显微镜Transmitted light microscopy光源穿透样品直接进入眼睛Good for measuring cell behavior~适合分析细胞的表型，不需要基因编辑荧光，比荧光成像更少的光损伤。fluorescence microscopy的光源照射样品激发样品经过反射进入眼睛Good for measuring molecular behavior~适合研究分子的行为此外，你并不总是需要很贵的显微镜才能解决问题。以下是两个超便宜显微镜完美解决问题的例证： 小编自己用明场显微镜拍摄的伤口愈合过程的细胞迁移 （Hao et al, EMBO Rep. e48385）研究细胞迁移的，研究微管的暗场显微镜（Horio and Hotani, Nature 321:605-7,1986）
Part III 如果选了荧光显微镜…如果你选择了荧光显微镜，你仍然需要问自己：1，Are you looking at a thick or thin specimen? 你是在看厚的还是薄的样品？(成像深度)2，Are you looking at a living sample or a fixed sample? 你是在看活细胞还是固定细胞？（采样率和细胞损伤）Epifluorescence 宽场显微镜优点：low cost (no laser) 成本低（木有激光）Easy to use 容易用，大多数实验室很容易配备缺点：Lower SNR (out of focus fluorescence) 信噪比较低（因为有聚焦面之外的荧光）More damaging to live cells. 对活细胞会造成较大损伤即使现在各种高端的显微镜开始满天飞，像这样的显微镜有很好的用武之地：比如：Good for 96-well KD screen~ 此时你只需要一标记简单的荧光信号，使用最多40X的物镜来进行有和无的检测，就可以敲低是否有效果的结论。用于筛选的96孔板Deconvolution microscopy去卷积显微镜这种显微镜技术是通过计算过程，达到去除离开焦平面的光是效果对一般的实验室来说也是很好搭建，硬件上只需要宽场荧光显微镜+Z stepper。这两个一般显微镜是配备的。因此只需要购买用于去卷积的软件。去卷积前和去卷积后https://cam.facilities.northwestern.edu/588-2/deconvolution/Laser-based sectioning microscopy基于激光的切片显微镜如果以上显微镜不能满足于你的需求，那么需要求助于更高级的显微镜。这一部分讲基于激光的切片显微镜。首先，根据你要研究的问题，你的被研究物可能有以下几种类型：i） 被成像物在玻璃表面；ii）样品厚度小于100um；iii）样品厚度大于100umi) Object near the coverslip surface: 被成像物在玻璃表面TIRF, total internal reflection fluorescence此时你可以选择全内反射显微镜，一个微丝成像的例子微丝的宽场成像和TIRF成像 https://www.flickr.com/photos/mcammer/267971287我们的观测手段从来不只局限于光学信号，下面是一些很creative的方法学。TIRF成像用于蛋白组研究：抗体粘附于玻璃表面，pull down细胞内的蛋白复合物single molecule immunoprecipitation SiMPull assay, 2011 nature jain et al.TIRF成像用于测序技术：new DNA sequencing technologies also use TIRF imaging （ibiology course）ii) <100 um thick (cell):被成像物的厚度小于100 um，使用pin-hole microscopy 针孔显微镜，点状或者线状的扫描，或者转盘共聚焦显微镜都比较适合这个厚度。转盘共聚焦显微镜versus点扫描显微镜Spinning disk confocal 对活细胞成像友好，可以有更快的采样频率研究活细胞，动态问题，快速运动的首选Point scanning confocal (<100um)对固定样品友好，这种样品不太需要考虑光损伤。衍生出结合技术：基于photobleaching的研究分子dynamic的技术。Light Sheet microscopy光毯显微镜light sheet扫描示意图适合用于斑马鱼胚胎的成像, 图像来自EMBL centerlightaheet的优点是，低光损伤，更快的采集速率，所以很适合胚胎发育的研究。iii) >100 um thick (tissue):被成像物的厚度大于100umMulti-photon microscopy and array tomography双光子显微镜成像深度增加， 如100～500um 使用双光子显微镜。对于极其厚的样品，要考虑物理切割的方法array tomography。如整个脑，使用结合物理切割的显微镜：钻石刀切割的脑切片薄片Allen Institute 鼠脑的云图-Allen Institute Super-resolution microscopy超分辨显微镜如果你有一个问题，极好的匹配这些分辨率，显微镜会是一个解决问题的好工具。我们来看看几种著名的超分辨显微镜适配的分辨率是多少：Conventional，传统的显微技术: 200~250 nm at the bestStructured illumination，结构光照明：100nm, live imagingSTORM PALM STED 超分辨显微镜：～40nm most powerful for fixed samples.为了做比较，冷冻电镜Cryo-EM 的分辨率2~4 nm frozen samples unstained complex。现在还有结合冷冻电镜于超分辨荧光成像技术-光电联合技术。以下有一个例子彰显了生物学家敏锐的insight。他要研究的问题本身，很好的吻合了他所选择的技术的分辨率。SIM中心粒的研究。SIM研究不同的中心粒蛋白的形貌特征，Mennella et al, NCB 2012.Part VI 你所关注的，不仅是荧光More than just optics不仅是荧光新的探针来检测细胞内的过程voltage-sensitive microbial rhodopsin. 大鼠神经元中的动作电位。 Kralj et al, nature methods 2011.用光做工具：小编自己拍摄的用光遗传工具控制细胞迁移我的专业圈内大多数都是比我水平高的人，写这篇文章，也算给别人一个讨论的靶点，帮助自己查漏补缺了。———— e n d ————
