案例 09：高保真超分辨级样本-细胞微丝 3D Confocal 成像
🧪Protocol for high-fidelity Fixed Actin 3D Confocal Sample
- 追求高保真的细胞培养，应用 细胞高活力培养基 AB 液实现高活力和健康度的细胞培养，并在种成像子细胞前使用 细胞贴壁辅助液获得充分贴壁延展的细胞；
- 高保真微丝固定，使用 高保真固定液-微丝37 ℃固定细胞 10min；
- 使用 2ml 超纯制样 PBS简短的清洗细胞 3 次；
- 使用 制样伴侣-贴壁样本辅助染料孵育，保持湿润环境，室温孵育 1 小时，致 4 度过夜更佳。染料选择 abberior STARRed Phalloidin。
- 使用 2ml 超纯制样 PBS简短的清洗细胞 3 次；
- 使用 超分辨光镊级 PFA-16%，预制成 4% 浓度，取 500ul 浸没样品进行后固定，时间 10min。
- 使用 2ml 超纯制样 PBS简短的清洗细胞 3 次；
- 不封片，在成像时，选择使用 Antifade 成像缓冲液进行高质量 STED 成像。
⭐ 图像描述：
图像是细胞局部的微丝网络，Z 轴位于细胞内部的边缘扁平处，位置是靠近细胞板状伪足区域。微丝的应力纤维致密但根分明，丝状结构清晰且连续，分布在 3D 范围内。颜色代表 Z 轴高度。
⭐ 标记要点：
- 选用适合微丝的高保真固定液，避免微丝解聚。
- 微丝是对温度极其敏感的细胞器。从培养基取出到固定的全过程，必须严格避免温度波动。
- 微丝聚合物仅有 5nm，尽可能减少步骤以保护精细纳米结构。
- 使用比常规推荐浓度更高的染料浓度去进行过饱和标记。过饱和标记，长时间标记。
- phalloidin 染料的发光对 PH 敏感，避免任何污染和 PH 波动。
- phalloidin 染料与部分封片剂不适配，尽量避免封片；若需要封片，请谨慎测试封片剂。
✨ 成像要点：
- 微丝结构多变，小视野传图应以结构丰富性为主。
- 锁焦/准焦：恒温在显微镜上放置十分钟，温度变化和机械形变全部趋于稳定，更利于锁焦。
- 选取 3D 拍摄范围：拍摄近的 7 层以上（for 3D 去卷积）细胞扁平，step 设置 0.05-0.1 μm。
🎨标记信息：
固定细胞直标染色
染料：phalloidin Alexa555
🔬成像模式：
3D SR confcal
Olympus SpinSR
Deconvolution
—— 案例 09 · 图文实验梳理 ——