案例 03：高保真超分辨级样本-细胞微管的 STORM 2D 成像
🧪Protocol for high-fidelity Fixed STORM 2D Sample
- 高保真微管固定，使用高保真固定液-微管37 ℃固定细胞 10min；
- 使用2ml 超纯制样PBS简短的清洗细胞 3 次；
- 压制背景荧光，使用2ml配置好的 自发荧光抑制剂，在室温下孵育样本 7min，使用侧摆摇床辅助交换液体；
- 使用2ml 超纯制样PBS简短的清洗细胞 3 次；
- 封闭抗体非特异性结合位点，使用 50ul 配置好的封闭打孔液，同时使用 制样伴侣-贴壁样本辅助样本的孵育，室温下孵育细胞 30 min；
- 使用 制样伴侣-贴壁样本辅助一抗孵育，保持湿润环境，室温孵育 1 小时。一抗选择 beta-tubulin E7 mouse；
- 使用 2ml 超纯制样PBS清洗一抗，5min 一次，清洗3次，使用侧摆摇床辅助交换液体；
- 抵御非特异性荧光染料结合，使用25ul 荧光净化增强液，同时使用 制样伴侣-贴壁样本辅助样本的孵育，室温孵育样本 30min；
- 使用 制样伴侣-贴壁样本辅助二抗孵育。保持湿润环境，室温孵育 1 小时。二抗选择 Alexa555 goat-anti-mouse IgG。
- 使用 2ml 超纯制样PBS清洗二抗，5min 一次，清洗3次，使用侧摆摇床辅助交换液体；
- 使用 超分辨光镜级PFA-16%，预制成 4%浓度，取 500ul 浸没样品进行后固定，时间10min。
- 在成像时，使用Antifade成像缓冲液，进行 STORM 2D成像。
⭐ 图像描述：
图像是细胞局部的微管网络，Z 轴位于细胞内部的中高处，位置是靠近细胞核，也靠近微管组织中心的微管致密区域。微管致密但根根分明，丝状结构清晰且连续，分布在 3D 范围内。颜色代表 Z 轴高度。
⭐ 标记要点：
- 培养贴壁良好、高活力且细胞体扁平的细胞。
- 微管是对温度极其敏感的细胞器。从培养箱取出到固定的全过程，必须严格避免温度波动。
- 选用适合微管的高保真固定液，防止微管解聚。
- 为使背景更干净，使用Quench试剂来抑制自发荧光。
- 使用比常规推荐浓度更高的一抗浓度去进行过饱和标记。
✨ 成像要点：
- 细胞存在异质性，精心挑选视野，以局部结构复合要求为主，可以不必以细胞整体扁平圆扇形为主，选择微管明亮且连续的区域。
- 该图像拍摄了Z轴连续7层以上的图像栈（Stacks）。层间距（Step size）设为 0.05~0.1 μm。
- 3D 层扫数据，非常适合进行 3D 去卷积处理，能极大提升共聚焦图像的信噪比（SBR）。
- 锁焦准备：恒温在显微镜上放置十分钟，温度变化和机械形变全都趋于稳定，更利于锁焦。
🍭 标记信息：
一抗：beta tubulin E7
二抗：Alexa555
🔬 成像模式：
3D SR confocal
Olympus SpinSR SoRa mode
Deconvolution
—— 案例 03 · 图文实验梳理 ——