案例 04：高保真超分辨级样本-细胞微管的 2D STORM 成像
🧪Protocol for high-fidelity Fixed 3D Confocal Sample
- 细胞抽提，使用样本基质净液化液，37 ℃抽提细胞 10秒；
- 高保真微管固定，使用高保真固定液-微管37 ℃固定细胞 10min；
- 使用2ml 超纯制样PBS简短的清洗细胞 3 次；
- 压制背景荧光，使用2ml配置好的 自发荧光抑制剂，在室温下孵育样本 7min，使用侧摆摇床辅助交换液体；
- 使用2ml 超纯制样PBS简短的清洗细胞 3 次；
- 封闭抗体非特异性结合位点，使用 50ul 配置好的封闭打孔液，同时使用 制样伴侣-贴壁样本辅助样本的孵育，室温下孵育细胞 30 min；
- 使用 制样伴侣-贴壁样本辅助一抗孵育，保持湿润环境，室温孵育 1 小时。一抗选择 beta-tubulin E7 mouse；
- 使用 2ml 超纯制样PBS清洗一抗，5min 一次，清洗3次，使用侧摆摇床辅助交换液体；
- 抵御非特异性荧光染料结合，使用25ul 荧光净化增强液，同时使用 制样伴侣-贴壁样本辅助样本的孵育，室温孵育样本 30min；
- 使用 制样伴侣-贴壁样本辅助二抗孵育。保持湿润环境，室温孵育 1 小时。二抗选择 Alexa555 goat-anti-mouse IgG。
- 使用 2ml 超纯制样PBS清洗二抗，5min 一次，清洗3次，使用侧摆摇床辅助交换液体；
- 使用 超分辨光镜级PFA-16%，预制成 4%浓度，取 500ul 浸没样品进行后固定，时间10min。
- 在成像时，使用5MLM成像缓冲液-STORM，进行 3D STORM成像。
⭐ 图像描述：
图像是细胞局部微管网格的2D STORM 成像，位置是圆扇形的细胞边缘扁平板状伪足区域，Z 轴是细胞的最低处。微管网稀疏，背景干净，标记密度高，采样数充足，分辨率高，可以看到清晰的微管中空结构。
⭐ 标记要点：
- 培养贴壁良好、高活力且细胞体扁平的细胞。
- 微管是对温度极其敏感的细胞器， 从培养箱取出到固定的全过程，必须严格避免温度波动。
- 选用适合微管的高保真固定液，防止微管解聚。
- 为使背景更干净，使用Quench试剂来抑制自发荧光。
- 使用比常规推荐浓度更高的一抗浓度去进行过饱和标记。
- 追求极致干净的细胞内背景，需要对细胞质进行抽提，去除细胞质中游离的 tubulin 蛋白，它们也可以被标记从而形成背景。
⭐ 成像要点：
- 细胞存在异质性，精心挑选视野，选择细胞整体扁平圆形，具有板状伪足，微管稀疏，细胞内背景低，微管明亮且连续的区域，以局部结构复合要求为主。
- 调节使SNR（信号背景比）最高的 TIRF 角度，最适配微管的角度不一定是最严格的 TIRF 角，但是在严格 TIRF 角的附近。
- 使用高活性的单分子闪烁缓冲液，保证单分子闪烁频率，保护单分子不淬灭。这是获得足够采样数的样本基础。
- 数据采集中，细胞保证收集离散的单分子信号，以确保真实的单分子定位，减少假定位。
- 采样过程中，需要采集足够多的单分子数量，充足的采样数以减少定位精度误差。
- 锐隼准备：恒温在显微镜上放置十分钟，温度变化和机械形变全部趋于稳定，更利于锐隼。
⭐ 标记信息：
IF
一抗：beta tubulin E7
二抗：Alexa647
⭐ 成像模式：
理论分辨率~20nm
实际分辨率~50nm（纺体尺寸叠加）
2D STORM mode
ONI nanoimager
—— 案例 04 · 图文实验梳理 ——